Биологические сенсоры как компоненты детектора для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ)

Авторам статьи удалось, используя компоненты живого организма, создать нейрофизиологический детектор, избирательно реагирующий на физичес­ки активные вещества. Особенности построения таких детекторов изложены в настоящей публикации.

И. Брондз*, Л. Каралёва, Д. Экэберг, Институт Молекулярных

Биологических наук Университета естествен­ных наук г. Осло, Норвегия

Richard Axel и Linda B. Buck были награждены в 2004 году Нобелевской премией за расшифровку ме­ханизма функционирования обонятельной системы.

В обонятельной системе человека более 1000 спе­циализированных рецепторов, которые могут различать более чем несколько тысяч индивидуальных за­пахов. У слона таких рецепторов в 5 раз больше и он может различать более 10 000 запахов. Обонятельная система – одна из старейших систем в организме че­ловека. Индивидуальный запах или букет запаховтрудно поддается описанию словами. Однако запахи играют важную роль в нашей жизни.

Пища в большой степени потеряла бы для нас вку­совые качества, если бы мы не обладали способ­ностью воспринимать ее запахи. Цветы также утрати­ли бы значительную степень своей привлекательно­сти, не обладай они душистым ароматом.

Долгое время ученые отрицали наличие у челове­ка разумного (Homo Sapiens) способности обонять сексуальные феромоны, то есть вещества, кодирую­щие социально-сексуальные сигналы. Однако недав­но было доказано, что и Homo Sapiens имеет эту спо­собность, причем женщины более тонко различают секс-феромоны. В природе особи различных полов одного и того же вида могут обладать значительным различием в пороге чувствительности к одному и то­му же запаху.

В животном мире запахи играют несравненно большую роль в общении индивидов одного вида, чем в человеческом обществе. Сообщество пчел или му­равьев немыслимо без языка запахов. Так как запах можно выделить как индивидуально чистое вещество, и определенный запах опознается соответствующим нервным рецептором, который посылает индивиду­ально закодированную информацию в виде электро­магнитного импульса вдоль нервного волокна в мозг живого организма, то это позволяет декодировать нервные сигналы, а значит понять язык рецепторов в передаче информации мозгу и изучить программы (software), используемые мозгом. Мозг представляет­ся нам как огромный компьютер. Его программное обеспечение нам неизвестно. Процесс мышления для нас – загадка. Но в основе наших эмоций лежат чувства страха, сексуального влечения и поиска пищи.

Схема постановки опыта

В 1938 году Карл фон Фриш описал реакцию страха карасей. Ему удалось выяснить, что панический страх у карасей вызывается веществом, выделяющимся в во­ду из кожи раненого карася. К. фон Фриш установил, что караси распознают это вещество при помощи обо­няния. Оно было названо веществом тревоги (alarm substances). По сей день химическая структура этого вещества (веществ) не расшифрована. В Университе­те Осло удалось выяснить, какие рецепторы восприни­мают вещество alarm substances и по каким нервным волокнам передаются сигналы тревоги в мозг, а также, как выглядит передающийся в мозг электромагнитный импульс, вызываемый веществом тревоги. В настоя­щее время также выяснены системы поиска пищи и ре­акция на секс-феромоны. Имеется три типа рецепто­ров. Молекулы запахов, растворенных в воде, вос­принимаются рецепторами обонятельного эпителия (olfactory epithelium) и вызывают в нейронах электро­магнитный импульс. Этот импульс передается в обоня­тельный узел (olfactory bulb) по дифференцированному каналу, в котором фильтруется, усиливается и направ­ляется в специализированные нервные волокна, а по ним проходит дальше в отдел мозга (telencephalon).

В эксперименте использовались самки карасевых рыб, так как они более чувствительны к запахам. Кара­севая рыбка была прооперирована так, что в тело ее обонятельного узла (olfactory bulb) был введен тонкий вольфрамовый электрод, подсоединенный к аппарату­ре, как показано на рисунке. Жидкостный хроматограф HPLC 1100 фирмы Agilent Technologies был использо­ван для разделения экстракта из кожи рыбы, в котором присутствовали вещества тревоги alarm substances.

Когда через разделительную колонку хроматогра­фа проходила мобильная фаза, нервная активность,

регистрируемая в обонятельных нейронах, принима­лась за базисную линию. Нервную активность можно было получить, вводя экстракт из кожи рыбы в мик­рокран, минуя разделительную насадочную колонку, что фиксировалось как положительная активность на вещество тревоги (alarm substances). В инъектор хро­матографа вводили экстракт из кожи карасевых рыб. После разделения на колонке индивидуальные веще­ства поступали в диодный матричный детектор (ДМД или Diode Array Detector – DAD), где регистрировались спектроскопически, далее проходили через микрок­ран и поступали в носовую полость рыбки (см. рис.). Когда в носовую полость поступала фракция, содер­жавшая вещество alarm substances, она вызывала нервную активность в рецепторах.

Экстракт из кожи карасевой рыбки в количестве 20 мкл, который вводился в инъектор и разделялся на хроматографической колонке, регистрировался при помощи детектора DAD и далее поступал в носовую полость рыбки. Носовая полость рыбки служила де­текторной ячейкой нейрофизиологического детекто­ра (НФД). Рецепторы olfactory epithelium служили дат­чиками сигнала, передаваемого в канал olfactory bulb, который служил фильтром и первичным усилителем сигнала.

Таким образом нам удалось зафиксировать инди­видуальное вещество, вызывающее страх. Динами­чески зарегистрированный спектр ультрафиолетового поглощения, представленный на симпозиуме “100 лет хроматографии” в Москве в 2003 году, и публикация в “Journal of Chromatography B” позволяют судить о химической природе вещества alarm substances.

Используя компоненты живого организма (нерв­ные клетки обонятельного эпителия как датчика сигна­лов; нервные клетки и нервные волокна обонятельно­го узла в качестве фильтра и первичного усилителя), удалось создать нейрофизиологический детектор, из­бирательно реагирующий на физиологически актив­ные вещества.

При небольшой модификации этот детектор мо­жет регистрировать секс-феромоны рыб и запахи, вызывающие рефлексы на пищу.

В более широком контексте подобные детекторы можно будет использовать для детектирования микро­доз лекарственных и наркотических препаратов, ток­синов и других физиологически активных веществ.

Выводы

В течение последних десятилетий ученых всего мира занимает вопрос создания электронных систем, базирующихся на биологических компонентах, преж­де всего на нервных рецепторах и специализирован­ных нейронах. Идея создания высокочувствительного и высокоселективного детектора, базирующегося на живых нервных клетках (как электронных компонен­тах), для использования в высокоэффективной жид­костной хроматографии (ВЖХ) была реализована в Институте Молекулярных Биологических наук Универ­ситета Осло в Норвегии .

Моделью послужили обонятельные системы кара­севой рыбы. Самостоятельной проблемой явилось исследование и выделение растворенных в воде ве­ществ, вызывающих страх у карасевых рыб. Реакция страха на определенные вещества у карасевых рыб была открыта почти 70 лет тому назад, однако до сих пор не удалось расшифровать природу этих веществ. Основным препятствием является чрезмерно низкая их концентрация, примерно 1 х10^-16 моль/л. Существу­ющие детекторы для ВЖХ недостаточно чувствитель­ны, кроме того, ни один детектор не реагирует на спе­цифическую физиологическую активность вещества, проходящего через детекторную ячейку измерения. Созданный нами из обонятельной системы и нервных придатков мозга карасевой рыбы детектор обладает уникальной способностью реагировать на присут­ствие веществ, вызывающих страх, строго опреде­ленными нервными импульсами.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ilia Biondz, El Hassan Hamdani and Kjell Doving, Neurophysiologic detector (NPD) – a selective and sensi­tive tool in high-performance liquid chromatography // Journal of Chromatography B, 800, p. 41, 2004.